实验六　免疫细胞的分离与纯化（外周血单个核细胞的分离）

免疫细胞的分离是体外检测机体免疫细胞功能的基础。外周血中含有多种细胞成分，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。外周血单个核细胞（PBMC）主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验最常用的细胞。外周血单个核细胞的分离是进行T细胞和B细胞分离与纯化的重要环节。一般常用的分离方法是密度梯度离心法。

实验目的

熟悉　外周血单个核细胞的分离技术。

基本原理

外周血单个核细胞（PBMC）的密度与血液中的其他成分不同。红细胞和粒细胞的密度较大，为1.092左右；淋巴细胞和单核细胞的密度为1.076～1.090；血小板为1.030～1.035。因此，利用一种密度为1.076～1.090而近于等渗的溶液（称为分层液）进行密度梯度离心，可使不同密度的细胞按其相应密度梯度分布，从而可将单个核细胞和其他血细胞分开。常用的分层液为聚蔗糖-泛影葡胺分层液（密度1.077±0.001）。

实验材料

（1）聚蔗糖-泛影葡胺（F-H）分层液（有成品供应，比重为1.077±0.001）、Hank's液（无Ca2+、Mg2+，pH 7.2～7.4）、肝素、台盼蓝染液、胎牛血清、RPMI-1640培养液。

（2）水平离心机、试管、离心管、吸管、毛细吸管、注射器、显微镜、细胞计数板等。

实验方法

（1）采集静脉血2ml注入盛有肝素的试管中（每毫升全血用0.1ml 125～250U/ml肝素溶液抗凝），加盖后立即轻轻摇匀，使血液抗凝。

（2）用吸管加入等体积的Hank's液，使血液等倍稀释（可降低红细胞的凝聚，提高分离效果）。

（3）将2ml F-H分层液从管底加入离心管中，然后将离心管倾斜45°，用毛细吸管吸取稀释血液，在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面（亦可将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加在稀释血液的下面），应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。

（4）将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下离心（2000r/min）20分钟，取出后可清楚看到管内容物形成不同层次的液体和细胞区带。上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，血浆层和分层液的界面处的白膜层为单个核细胞层。

（5）用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一试管中。加5倍以上体积的Hank's液或含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液混匀，离心（1500r/min）10分钟，弃上清液，重复洗涤2次。

（6）最后一次弃去上清液后，加0.4ml含20%胎牛血清的Hank's液重新混匀细胞，取细胞悬液1滴置细胞计数板内计数，然后根据实验需要用10%胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞稀释至所需浓度，此即为单个核细胞悬液。

（7）细胞活力检测。取单个核细胞悬液1滴加2%台盼蓝染液1滴混匀，5分钟后取样做湿片高倍镜检、计数。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞中着色的细胞数，求出活细胞的百分率。活细胞数应在95%以上。

实验结果

用本法分离单个核细胞的纯度可达95%，细胞获得率达80%以上，细胞活性达95%以上。

注意事项

（1）与血液样品接触时应注意生物安全防护，避免血源性传染病。

（2）吸取单个核细胞时，可以先吸去上层的血浆、稀释液及血小板，再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。

（3）细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一，最适密度在室温下应为1.077±0.001，应避光4℃冰箱保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用；使用中应避免细菌污染。

（4）离心时的温度对分离效果亦有影响，温度过低，淋巴细胞丢失增多，离心时间需适当延长；温度过高，增加红细胞凝聚，且影响淋巴细胞活性。离心时最适温度为18～20℃。

F-H分层液为密度梯度离心法最常用的分离液，其主要成分是聚蔗糖和泛影葡胺。聚蔗糖分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点；常用的聚蔗糖溶液浓度为6%，密度为1.020。泛影葡胺用来增加密度，适量加入密度为1.200、浓度为34%的泛影葡胺于聚蔗糖溶液中，配成密度为1.077±0.001的分层液，称为淋巴细胞分层液，用于淋巴细胞的分离。